Изменения окислительно-восстановительного потенциала среды культивирования устойчивой к тяжелым металлам бактерии Pseudomonas diminuta : взаимосвязь с выделением из клеток металлотионеинподобных белков
Особое положение тяжелых металлов (ТМ) среди загрязнителей связано как с возможностью их накопления организмами и передачи по пищевым цепям, так и с высокой токсичностью (Reddy, Prasad, 1990). Воздействие ТМ прежде всего сказывается на первичных продуцентах - микроводорослях и цианобактериях, которые наравне с гетеротрофными микроорганизмами могут использоваться для детоксикации и извлечения ценных металлов, поскольку способны аккумулировать их из водной среды и донных отложений в количестве, многократно превышающем потребность в них, как в компонентах минерального питания (Nagase et al., 1994). Наибольшей устойчивостью к ТМ отличаются микроорганизмы, выделенные в местах, содержащих промышленные загрязнения, либо месторождения соответствующего металла (Горленко и др., 1977).
Ванадий, как один из широко распространенных ТМ, используется зелеными, желто-зелеными и бурыми водорослями, содержится в альтернативных нитрогеназах некоторых почвенных бактерий, но не является необходимым элементом для развития большинства прокариотных микроорганизмов, среди которых наиболее активными биоаккумуляторами ванадия являются бактерии рода Pseudomonas , а также ряд цианобактерий (Rehder, 1991). Его токсический эффект обусловлен главным образом тем, что восстанавливаясь в клетках, он стимулирует образование свободнорадикальных состояний О 2 (Popper et al., 1991).
Ионы ТМ образуют меркаптиды с SH-группами тиоловых соединений клеток: реакция обратима, но равновесие ее смещено в сторону слабодиссоциирующих металлтиолатов (Торчинский, 1977). Устойчивость фототрофных и других микроорганизмов к действию ТМ в наибольшей степени обусловлена специфическим связыванием основной части поглощенных клетками ТМ смежными остатками цистеина в молекуле специализированных белков - металлотионеинов (МТ). Общим для этих белков является молекулярная масса до 10 кДа и высокое содержание тиоловых групп. В спектре оптического поглощения МТ в УФ-области около 250 нм, наблюдаются типичные для металлтиолатных комплексов шиpокие полосы, которые исчезают пpи удалении металла (Ang, Wong, 1992). Цианобактерии, культивируемые в присутствии высоких концентраций ванадата синтезируют связывающий ионы металла МТ второго класса (Саванина и др., 1995).
В настоящей работе установлена корреляция между зависимым от ванадата накоплением в среде культивирования бактерий Ps. diminuta низкомолекулярных, богатых SH-группами белков и изменениями окислительно-восстановительного потенциала (E h ) среды.
Материалы и методы
В работе использовали гетеротрофные бактерии, выделенные из придонного осадка ванадийсодержащего промышленного водоема и идентифицированные нами как Ps. diminuta (Саванина и др., 1998). Бактерии культивировали при температуре 25-27° в конических колбах на среде, содержащей в 100 мл водопроводной воды глюкозу и пептон в концентрации по 1 г/л (pH 7,2).
Для определения в культуральной жидкости Ps. diminuta содержания низкомолекулярных белков и SH-групп пробы диализовали 24 час при 0о против 50 мМ Трис-HCl буфера, pH 7,6, включающего 10 мМ ЭДТА с использованием мембраны фирмы Serva (Германия) с диаметром пор, пропускающих молекулы массой <10-15 кД. В присутствии ЭДТА, сульфгидрильные группы МТ и других SH-содержащих соединений освобождаются от большей части связанного ванадия и становятся реакционноспособными.
Плотность клеточных суспензий определяли нефелометрически при 540 нм на спектрофотометре фирмы Hitachi (Япония), модель U-2000. Для определения концентрации ванадия в биологическом материале и культуральной жидкости использовали цветную реакцию ванадия с 4-(2-пиридилазо)-резорцином. Клетки предварительно трижды отмывали от среды культивирования и озоляли азотной кислотой. Оптическую плотность измеряли на том же спектрофотометре при 520 нм используя коэффициент молярной экстинкции 24500 М -1 см -1 . Содержание диализованных низкомолекулярных белков определяли по Лоури (Lowry et al., 1951). Концентрацию тиоловых групп в этих белках и других соединениях определяли с реактивом Элмана (5,5'-дитиобис(2-нитробензойная) кислота) в присутствии ЭДТА (Веревкина и др., 1977) и регистрировали при длине волны 412 нм на том же спектрофотометре используя коэффициент молярной экстикции 11400 М -1 см -1 . Величины pH и E h среды култивирования измеряли на электрометре фирмы Cole-Parmer (США), модель DigipHase, pH определяли с помощью комбинированного стеклянного электрода с двойным Ag/AgCl электродом сравнения фирмы Radiometer (Голландия); для определения E h использовали Pt-электрод, а в качестве электрода сравнения - Ag/AgCl (оба электрода Российского производства); потенциал электрода сравнения относительно нормального водородного электрода, измеренный как в работе (Barsky, Samuilov, 1979), составляет 225±10 мВ. Таким образом, истинная величина E h среды представляет собой сумму измеряемой величины E h и потенциала электрода сравнения.
Рис. 1. Эффект ванадата на рост культуры Ps. diminuta ; 1 - контроль; 2, 3 - в присутствии 100 и 700 мг/л ванадата соответственно.
Результаты и их обсуждение
Клетки Ps. diminuta , изолированные из пробы придонного осадка промышленного водоема, сбросовые воды которого содержат как отходы металлургического производства ванадий в концентрации 100-700 мг/л, хорошо растут как без ванадата, так и в его присутствии; при этом максимальное количество клеток бактерий достигает 2x10 7 кл/мл среды через 12-16 суток культивирования (рис. 1). Ванадат в концентрации 700 мг/л снижает накопление биомассы Ps. diminuta на 30-40%. В дальнейших опытах ванадат добавляли в концентрации 100 мг/л, поскольку не оказывая заметного влияния на рост бактерий, ванадат в этой концентрации значительно стимулировал выделение из клеток низкомолекулярных белков.
Применение метода диализного (смешанно-раздельного) культивирования фототрофных микроорганизмов - цианобактерий или микроводорослей с гетеротрофными бактериями рода Pseudomonas (Гусев и др., 1988) позволило выявить ряд закономерностей роста двух различных культур, разделенных полупроницаемой мембраной. При культивировании фототрофного компонента в присутствии ванадата клетки активно выделяют в среду углеводы и гликолат. Эти соединения используются для роста гетеротрофным компонентом в качестве субстратов окисления. При этом бактерии эффективно поглощают ванадат, существенно снижая его концентрацию в среде (Саванина и др., 1994; Гусев и др., 1997).
Рис. 2. Содержание ванадата в клетках (1) и в среде (2) в зависимости от возраста культуры Ps. diminuta .
Действительно, как показывают наши опыты содержание ванадата в клетках Ps. diminuta , в течение первых 2 суток культивирования быстро увеличивается от 0 до 5-6 мкг/млн клеток, а затем снижается приблизительно в 10 раз (рис. 2, кривая 1). Иная картина наблюдается относительно концентрации ванадата в культуральной жидкости. За первые двое суток культивирования Ps. diminuta содержание ванадата в среде падает от 100 до 10-12 мг/л, а затем начинает постепенно увеличиваться по мере развития культуры; причем в среду возвращается до 60% ванадата (рис. 2, кривая 2). Как видно, накопление ионов ванадия в клетках коррелирует c его содержанием в культуральной жидкости: увеличение концентрации ванадата в клетках сопровождается ее снижением в среде культивирования и наоборот.
Столь значительное увеличение концентрации ванадата в среде по мере выхода кривой роста на стационарный уровень может быть обусловлено тем, что ванадат выделяется из нативных и разрушенных клеток вместе с компонентами связывающими металл. Такими компонентами прежде всего являются низкомолекулярные богатые SH-группами белки; могут быть и другие тиоловые соединения, к которым относятся глутатион, цистеин, тиогликолевая кислота, дитиоэтанол, дитиопропанол и т.д.
Известно, что специфическую устойчивость фототрофных микроорганизмов к действию ТМ обеспечивает наличие в клетках SH-содержащих белков с мол. м. до 10 кДа, связывающих большую часть поглощенных клетками ТМ (Obata et al., 1994). Содержание низкомолекулярных белков и коррелирующее с ним содержание SH-групп в клетках цианобактерий возрастает под действием ванадата (Лебедева и др., 1993). Выделенный из клеток Anacystis nidulans белок был идентифицирован как МТ II класса, связывающий ванадий (Саванина и др., 1995). Известно, что МТ большинства прокариот как правило состоят из одной полипептидной цепи с мол. м. до 7-10 кДа и высоким содержанием цистеина (в среднем до 30%) (Kagi, 1993). Клетки Ps. fluorescens выделяют в среду связывающие ионы Zn полипептиды с мол. м. 1-3,5 кДа. (Appana, Whitmore, 1995). Поскольку клетки Ps. diminuta выделены из ванадийсодержащего промышленного водоема и по данным рис. 1 устойчивы к действию ванадата, представляет интерес определение содержания низкомолекулярных белков и SH-групп в культуральной жидкости Ps. diminuta в динамике развития культуры.
Рис. 3. Зависимость содержания низкомолекулярных белков (1, 2) и SH-групп (3, 4) в среде от возраста культуры Ps. diminuta . 1, 3 - контроль; 2, 4 - в присутствии 100 мг/л ванадата.
Как видно из рис. 3 в среде культивирования Ps. diminuta наблюдается накопление низкомолекулярных белков, содержание которых к 12 суткам составляет около 50 мкг/мл (кривая 1). В присутствии ванадата количество белка к этому периоду времени возрастает до 450 мкг/мл (кривая 2). Это согласуется с ранее полученными данными о стимуляции синтеза МТ у цианобактерий (Лебедева и др., 1993; Саванина и др., 1995) и в клетках животных организмов (Gachot et al., 1994).
Подобным образом ванадат стимулирует накопление SH-групп низкомолекулярных белков и, возможно, других тиолсодержащих соединений в среде культивирования Ps. diminuta (рис. 3, кривые 3 и 4); зависимости содержания SH-групп в среде от возраста культуры имеют колоколообразный характер с максимумом, приходящимся на 8-9 сутки. Кажущееся несоответствие характеров накопления SH-групп и белка в среде (наличие спада в содержании SH-групп, тогда как по белку такого спада нет), может быть обусловлено окислением SH-групп кислородом, которое должно значительно усиливаться при значениях pH выше 7, как это показано ранее для цистеина (Barsky et al., 1984). Действительно, в соответствии с нашими данными pH культуры Ps. diminuta с возрастом увеличивается от 7 до 8,5; в присутствии ванадата величины pH на 0,3-0,5 единицы выше, чем в контроле.
Рис. 4. Изменения величины E h среды в динамике развития культуры Ps. diminuta . 1 - контроль; 2 - в присутствии 100 мг/л ванадата.
Колоколообразная зависимость накопления SH-групп в среде от возраста культуры Ps. diminuta сопровождается сходной зависимостью снижения E h среды. По мере развития культуры величина E h уменьшается и достигает минимума (180-200 мВ) к 6-8 суткам, а затем вновь возрастает (рис. 4, кривая 1). В присутствии ванадата минимальное значение E h достигает 80 - 90 мВ (кривая 2). Столь низкие значения E h в аэробных условиях могут быть обусловлены только наличием в среде значительных количеств тиолсодержащих соединений, стандартный редокс-потенциал которых в анаэробных условиях существенно ниже 0 мВ. Так, например, 1,4-дитиотреитол, эффективно восстанавливающий SH-группы ферментов и кофакторов, имеет стандартный потенциал -330 мВ при pH 7; сходными окислительно-восстановительными свойствами обладают тиогликолевая кислота, 2-меркаптоэтанол, димеркаптопропанол и др. (Досон и др., 1991).
В отличие от тиолов такие соединения, как органические кислоты, имеют стандартные редокс-потенциалы в интервале от 50 до 250 мВ. Согласно нашим данным (рис. 5) для достижения величины E h около 200 мВ содержание аскорбата в среде в аэробных условиях должно составлять несколько мМ (кривая 2), а в случае гликолата его концентрация при E h около 300 мВ достигает 200-400 мМ (кривая 3).
Рис. 5. Зависимость величины E h от концентрации SH-групп цистеина, инкубируемого в 20 мМ буфере морфолинопропансульфонате (pH 7,0).
На рис. 5 также показана зависимость величины E h буферного раствора от концентрации SH-групп цистеина (кривая 1). Видно, что величинам E h около 200 и 100 мВ соответствуют концентрации SH-групп около 20 и 120 мкМ. Эти значения согласуются с величинами E h (рис. 4) и концентрациями SH-групп (рис. 3) в культуральной жидкости Ps. diminuta .
Таким образом, полученная корреляции между содержанием ванадата в клетках и культуральной жидкости Ps. diminuta , накоплением низкомолекулярных белков и SH-групп и изменениями E h среды культивирования бактерий позволяют полагать, что ионы ванадия, поглощенные клетками Ps. diminuta стимулируют образование тионеинподобных белков, связываются с ними с участием SH-групп и выделяются из клеток вместе с белками, продуктами их деградации или с другими тиоловыми соединениями.
Список литературы
