Фотосинтетический кислород: роль H 2 O 2
По современным представлениям фотосинтетический кислород выделяется из воды. Имеется ряд соединений, аналогов H 2 O, взаимодействующих с водоокисляющим комплексом. Среди них особый интерес представляет пероксид водорода в связи с его возможным участием в фотосинтетическом выделении O 2 . Существуют предположения об H 2 O 2 как промежуточном продукте окисления H 2 O и даже как об исходном субстрате-доноре электронов. У некоторых цианобактерий и водорослей выделение O 2 прекращается в анаэробных условиях. Исследования роли H 2 O 2 в фотосинтетическом выделении O 2 представляются перспективными.
According to current views, the photosynthetic oxygen is evolved from the water. There is a number of compounds, of the H 2 O analogues, interacting with the water-oxidizing complex. Among these compounds, of particular interest is hydrogen peroxide as a possible participant in photosynthetic O 2 evolution. There are the assumptions of H 2 O 2 as an intermediate in H 2 O oxidation and, moreover, as the starting electron donor substrate. In several cyanobacteria and algae, O 2 evolution in the light is ceased under the anaerobic conditions. The elucidation of the H 2 O 2 role looks promising for the studies on photosynthetic O 2 evolution.
Фундаментальная проблема биохимии - механизм фотосинтетического выделения кислорода. Проблема не нова, возникла со времен Джозефа Пристли, открывшего в 1771 г. фотосинтетический кислород. Важность ее решения трудно переоценить: космическая роль зеленого листа по К.А.Тимирязеву заключается в фотосинтезе органических веществ и молекулярного кислорода - субстратов, обеспечивающих жизнедеятельность хемотрофных организмов. Проблема фотосинтетического кислорода имеет комплексный характер, исследования ведутся во многих лабораториях мира. В последние годы в решении проблемы наметился определенный прогресс. Наряду с фундаментальностью, проблема имеет и прикладную перспективу, в частности, ее решение позволило бы использовать принципы фотосинтетического механизма для получения из воды молекулярного водорода в качестве энергоносителя.
По современным представлениям фотосинтетический кислород выделяется из воды [1]. Фотосистема (ФС) II хлоропластов и цианобактерий функционирует как H2O:пластохинон-оксидоредуктаза [2]:
H 2 O → (Mn) 4 → Y Z → P680 → Фео → Q A → Q B Q P → Q Z ( b 6 f ),
где (Mn) 4 - четырехъядерный Mn-кластер водоокисляющего комплекса (ВОК), Y Z - остаток тирозина-161 в полипептиде D1 фотосистемы II, P680 - реакционный центр ФСII, Фео - промежуточный акцептор электронов (феофитин), Q A и Q B - первичный и вторичный пластохиноны, Q P - мембранный фонд пластохинона, Q Z - участок связывания пластохинона в b 6 f -цитохромном комплексе.
Окисление H 2 O включает четыре одноэлектронные стадии, приводящие к последовательному накоплению окислительных эквивалентов в Mn-кластере. Соответственно, Mn-кластер может находиться в пяти различных окислительно-восстановительных состояниях, обозначаемых символами S 0 -S 4 . Состояния S 0 и S 1 стабильны в темноте, S 4 превращается в S 0 сопряженно с выделением O 2 , состояния S 2 и S 3 не устойчивы и релаксируют в темноте в состояние S 1 за десятки секунд. В темноте соотношение S 1 : S 0 составляет 3-4, поэтому в условиях импульсного освещения, когда каждая световая вспышка вызывает один оборот P680, максимальный выход O 2 из H 2 O наблюдается в ответ на третий импульс; на первый импульс O 2 не выделяется.
Данные структурных исследований позволяют предположить, что (Mn) 4 представляет собой димер из двух биядерных центров. Это согласуется с данными о функциональной неоднородности четырех Mn-центров (см. [3] и цитированную там литературу). Одна из (Mn) 2 -групп, (Mn-Mn) ВОК , образует каталитический центр ВОК; другая, (Mn-Mn) C , по-видимому, служит регулятором функциональной активности (Mn-Mn) ВОК . Существует ряд соединений, аналогов H 2 O, взаимодействующих с ВОК. Так, окисление NH 2 OH и NH 2 NH 2 ведет к образованию сверхвосстановленных состояний (Mn) 4 -кластера - состояний S -1 и S -2 [3]: протекают реакции S 1 → S -1 и S 2 → S -2 , которые в рамках представлений о биядерных (Mn) 2 -группах могут соответствовать переходам:
и
Особый интерес среди аналогов H 2 O представляет пероксид водорода. В присутствии H 2 O 2 хлоропласты выделяют O 2 в ответ на первый световой импульс [4]. Этот результат подтвержден в опытах с H 2 18 O 2 [5]. В темноадаптированных тилакоидах хлоропластов H 2 O 2 вызывает переход S 1 → S -1 [4, 5]. При этом устанавливается соотношение S 0 : S -1 : S 1 , близкое к 0 : 6 : 4 [5]. Состояние S -1 стабильно и не релаксирует, по меньшей мере, в течение 15 мин [5]. Одиночный световой импульс вызывает переход S -1 /S 1 → S 0 /S 2 , который инициирует темновую реакцию окисления H 2 O 2 с образованием O 2 [4,5]. Как продемонстрировано в опытах с H 2 18 O 2 , весь O 2 выделяется из H 2 O 2 [5], в расчете на 1 P680 после одиночной вспышки света выделяется более 20 молекул O 2 . Эта реакция, подобная каталазной реакции, предположительно обусловлена восстановлением S 2 до S 0 посредством H 2 O 2 (E 0 ' для O 2 /H 2 O 2 равен 0,295 В) и последующим H 2 O 2 -зависимым окислением S 0 до S 2 (E 0 ' для H 2 O 2 /H 2 O равен 1,42 В). Реакции S-состояний, вызываемые H 2 O 2 , иллюстрирует схема (по [5]).
Переходы S 2 → S 1 и S 0 S -1 приводят к постепенному затуханию темнового выделения O 2 из H 2 O.
Имеются данные о том, что выделение O 2 из H 2 O 2 в результате циклического перехода S 2 → S 0 → S 2 возможно без предварительного воздействия одиночным световым импульсом [6-8]. Процесс зависит от (Mn) 4 , Ca 2+ и Cl - [6]. Эти данные, однако, подвергнуты критике [9]. В частности, комплексы ФСII, лишенные субъединиц ВОК с молекулярной массой 17 и 24 кДа ( на которых проводились опыты [6-8]), по данным работы [10] при воздействии H 2 O 2 теряют Mn, а по данным работы [8] полностью сохраняют его и при этом характеризуются отсутствием шестиполосного сигнала ЭПР от Mn 2+ , находящегося в водном окружении. Утверждается [9], что такой сигнал в условиях комнатной температуры, в которых проводились измерения [8], должен регистрироваться и в образцах с нативным Mn-кластером ВОК. Тилакоидные мембраны, обедненные Cl - , не способны к фотоокислению H 2 O, но выделяют O 2 из H 2 O 2 на свету [11]. Опыты с антибиотиком A23187 (осуществляющим трансмембранный обмен двухвалентных катионов на 2H+) и данные о действии добавленного Mn 2+ склонили авторов работы [11] к предположению о том, что фотоокисление H 2 O 2 в таких мембранах катализируется свободным или лабильно связанным Mn, возникающим в результате H 2 O 2 -зависимой деструкции (Mn) 4 , входящего в состав ВОК. Добавленный Mn2+ поддерживает окисление H 2 O 2 в тилакоидных мембранах, обогащенных ФСII и предварительно лишенных Mn [12].
Таким образом, к настоящему времени нет ясности по вопросу, нужен ли для выделения O 2 из H 2 O 2 интактный ВОК. Или этот процесс протекает и после деструкции ВОК? В этом случае пути окисления H 2 O и H 2 O 2 расходятся, и тогда изучение разложения H 2 O 2 в качестве подхода для познания механизма выделения O 2 из H 2 O теряет смысл.
Однако имеются данные, полученные с применением другого подхода. В определенных условиях электрон-донорная ветвь ФСII может генерировать H 2 O 2 . Образование H 2 O 2 на свету вызывают ADRY-реагенты (ADRY - от английского "Acceleration of Deactivation Reactions of the Water-Oxidizing Complex Y", см. [2] в качестве обзора) [13] - соединения, которые, окисляясь, ускоряют дезактивацию S 2 - и S 3 -состояний с образованием S 1 . H 2 O 2 образуется в вывернутых тилакоидных мембранах, если они лишены 16- и 23 кДа-полипептидов ВОК [14]. Процесс зависит от добавленного Mn 2+ и подавляется ЭДТА. Освещение мембран, обогащенных ФСII в результате обработки детергентом, тоже приводит к образованию H 2 O 2 [15, 16], как предполагают авторы, в электрон-донорной ветви ФСII.
H 2 O 2 , образованный в электрон-донорной ветви ФСII, высвобождается лишь при кислотной обработке мембран - при снижении pH до 1,4 [15]. Связанный H 2 O 2 образуется на первую вспышку света, на последующие вспышки наблюдаются осцилляции с периодом в два такта: на нечетные вспышки H 2 O 2 образуется, а на четные - исчезает. Выход связанного H 2 O 2 составляет 0,35 моль на 1 моль P680. Связанный H 2 O 2 образуется и в мембранах, лишенных Mn, но без осцилляций на последовательные вспышки света [15].
Условием образования H 2 O 2 по данным работы [16] является помещение мембран в гипотоническую среду с низкой концентрацией сахарозы. Если в качестве акцептора электронов в реакции Хилла использовать 2,6-дихлорфенолиндофенол (ДФИФ), то количество фотовосстановленного ДФИФ в расчете на электронные эквиваленты более чем в 1,5 раза превышает количество выделенного O 2 . Разница стирается при добавлении каталазы [16]. Это свидетельствует о том, что значительная доля электронного транспорта через ФСII имеет результатом не выделение O 2 , а образование H 2 O 2 [16]. Предлагаются два возможных варианта объяснения полученных результатов [16]: образование H 2 O 2 как промежуточного продукта на пути окисления H 2 O до O 2 или как продукта, возникающего в результате замыкания цикла S-состояний (S 2 - или S 3 -состояния Mn-кластера релаксируют соответственно в S 0 или S 1 с высвобождением H 2 O 2 ).
Таким образом, и этот подход не дает однозначных результатов относительно роли H 2 O 2 в фотоокислении H 2 O. Более того, при одноэлектронном восстановлении O 2 компонентами электрон-акцепторных ветвей ФСII и ФСI образуется O 2 -. (см. [17] и цитированную там литературу). В изолированных хроматофорах пурпурных бактерий окисляется вторичный хинон, наиболее вероятно, в форме семихинона [18, 19]. При обработке хроматофоров детергентами с O 2 взаимодействует бактериофеофитин [20]. В модельных системах кислородом окисляются фотовозбужденные хлорофилл а и бактериохлорофилл а [21, 22]. Комплексы ФСII обладают высокой активностью супероксиддисмутазы [17], катализирующей реакцию:
2O 2 -. + 2H + → H 2 O 2 + O 2 .
Применение еще одного подхода, "эволюционного", к проблеме фотосинтетического кислорода представляется перспективным. Эволюционно творцами оксигенного фотосинтеза стали цианобактерии. Многие из них образуют на свету H 2 O 2 [23]. Перенос электронов на O 2 с последующим образованием H 2 O 2 у цианобактерии Microcoleus chtonoplastes достигает 40% общего потока электронов через ФСII [24]. Исследованная цианобактерия имеет высокую активность супероксиддисмутазы и не содержит каталазы [24].
В условиях импульсного освещения изолированные тилакоиды Oscillatoria chalybea выделяют O 2 в ответ на первую световую вспышку (см. [25] и цитированную там литературу). Такие же данные получены с представителями Synechocystis и Synechococcus . Масс-спектрометрический анализ показал, что освещение мембран O. chalybea в присутствии H 2 18 O 2 или 18 O 2 в газовой фазе приводит к выделению 18 O 2 . Сделан вывод о том, что 18 O 2 , добавленный в газовую фазу, растворяется в водной фазе, поглощается мембранами и превращается в компонент, который окисляется при освещении с выделением 18 O 2 . Данные изотопного распределения ( 16 O 2 , 16 O 18 O, 18 O 2 ) показывают, что кислород выделяется не из H 2 18 O, поскольку сигнал 16 O 18 O, который неизбежно должен возникать при окислении воды, невелик. Следовательно, 18 O 2 выделяется из H 2 18 O 2 , образующегося в результате темнового поглощения 18 O 2 из газовой фазы [25]. Фотоокисление воды у O. chalybea тоже происходит, но доля H 2 O в светозависимом выделении O 2 значительно ниже, чем доля H 2 O 2 . В анаэробных условиях выход O 2 на свету существенно снижается, при этом подавляется выделение O 2 из H 2 O 2 , но не из H 2 O [25]. Анаэробиоз ингибирует также фотовыделение O 2 зеленой водорослью Ulva sp. [26].
Таким образом, для фотосинтетического выделения O 2 указанными организмами требуется, чтобы в среде содержался O 2 , наиболее вероятно, как субстрат для образования H 2 O 2 . Предполагается, что H 2 O 2 является эволюционным предшественником H 2 O в качестве донора электронов для ФСII [25].
Более того, выдвинуто предположение [27], что в ходе современного фотосинтеза O 2 выделяется не из H 2 O, а из H 2 O 2 экзогенного и эндогенного (внутриклеточного) происхождения.
Процессы образования H 2 O 2 в атмосфере и природных водоемах, а также в клетках микроорганизмов подробно рассмотрены в обзоре [28]. Отметим лишь, что согласно расчетам [28] на каждый квадратный метр поверхности суши и океанов за год с осадками выпадает ~ 200 г H 2 O 2 [28], до 15% O 2 , потребляемого организмом животного, превращается в H 2 O 2 [29]. Генераторами H 2 O 2 в фотосинтезирующей клетке являются тилакоидные мембраны, митохондрии, пероксисомы, эндоплазматический ретикулум. Концентрация H 2 O 2 в водоемах в среднем составляет 10 -6 М [28]. Для использования в фотосинтезе маловато. Поэтому предполагаются механизмы концентрирования H 2 O 2 в клетке, например, в результате транспирации [27]. Напомним, что концентрация CO 2 в воздухе тоже невелика - 0,03%.
Если H 2 O 2 принять в качестве эволюционного предшественника H2O как донора электронов при фотосинтезе, то для образования H 2 O 2 был необходим O 2 . Мог ли O 2 появиться в добиогенный период развития Земли? Кислород современной земной атмосферы на 2,3% тяжелее кислорода, образующегося фотосинтетически [30]. Следовательно, помимо фотосинтеза должен быть другой источник O 2 , поставляющий его в атмосферу. "...свободный кислород в газовой фазе появился на Земле в глубокой древности, т.е. в раннем докембрии, в результате дегазации базальтовой магмы, подобно тому как появились в атмосфере и другие газы. Более того, он продолжает поступать из земных недр до настоящего времени. Магма является тем первым мощным источником кислорода в природе, который определяет количество и качество его в атмосфере совместно с появившимся несколько позднее кислородом фотосинтетическим" ([30], стр. 10). Кислород современной атмосферы на 30% имеет фотосинтетическое и на 70% геологическое (из земных недр) происхождение [30]. По данным минералогии, как было отмечено В.Н.Вернадским [31], в пределах научно изученных геологических периодов состав воздуха не менялся.
Рассмотренные данные показывают, что H 2 O 2 , возможно, играет важную роль в системе фотосинтетического выделения O 2 , однако эти данные не поддаются однозначной интерпретации. H 2 O 2 - промежуточный продукт окисления H 2 O или исходный субстрат-донор электронов? Пока нельзя даже ответить на вопрос: H 2 O 2 - это хорошо или плохо для фотосинтеза? Имеются данные о пагубном действии H 2 O 2 . H 2 O 2 , образующийся как в электрон-донорной, так и в электрон-акцепторной ветви ФСII, вызывает фотоингибирование ВОК [32].
Таким образом, представление о воде как доноре электронов и источнике кислорода при фотосинтезе не является однозначным. В последние годы появились данные об участии H 2 O 2 в фотосинтетическом выделении O 2 . Исследования в этой области представляются перспективными.
Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (грантом 94-04-12227-а).
Список литературы
